杨树NaH反向运输蛋白基因PtNHX1、PtNHX6的克隆与检测.pdf 8页VIP

第 卷 第 期 林 业 科 学 ， 年 月 ， !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 杨树 反向运输蛋白基因（ 、 ） 的克隆和检测 张德强 赵树堂 卢孟柱 田 林 （中国林业科学研究院林业研究所 国家林业局林木培育重点实验室 北京 ） 摘 要： 反向运输蛋白基因（ ）是在细菌、植物和动物体内普遍存在的一类膜蛋白基因家族。迄今已 在模式植物拟南芥中分离出 、 、 、 、 和 共 个成员，并发现部分成员对 盐胁迫有不同程度的响应。以 和 的 核苷酸序列为信息探针，基于可利用的杨树 数据库 和毛果杨全基因组测序结果，通过电子杂交辅助的克隆技术，从毛白杨形成层 中分离得到长度分别为 和 的 个 ，其分别含有编码 个和 个氨基酸残基的完整开放阅读框。由它们所推导的蛋白质 序列与拟南芥、水稻、小麦和玉米的 和 基因的蛋白质序列高度同源，同源性分别为 、 、 和 以及 、 、 和 ，故将其命名为 和 （ 注册号分别为 和 ）。 杂交分析表明， 和 均为低拷贝基因（或有一些高度同源的基因），在杨树基因 组中以 个拷贝形式存在。组织特异性 结果显示， 和 基因在杨树根、茎和叶片中均有 表达，但其表达模式稍有不同： 在根部、形成层、未成熟木质部、成熟叶和嫩叶中均高度表达，在韧皮部和成 熟木质部中有少量表达，而 在根部、成熟叶和嫩叶中表达丰度较高，在韧皮部、形成层、未成熟木质部表达 丰度较低，在成熟木质部中表达丰度极低。 诱导的杨树叶片差异表达 检测结果初步表明， 和 基因均受盐诱导表达，当溶液中 浓度在 · 内，随着盐浓度的提高， 和 基因的表达丰度逐渐增强，但超过 · 后，其表达丰度均有所降低，这与所测定的叶片 含量匹配。 关键词： 杨树； 反向运输蛋白；反转录 ；盐诱导的差异表达 中图分类号： ； 文献标识码： 文章编号： （ ） （ ， ） （ ， ， ） ： ， ， ， （ ） （ ）， （ ） ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， （ ） ， ， ， ， ， ， ， 收稿日期： 。 基金项目：国家自然科学基金项目（ ）和国家重大基础研究项目（ ）资助。 林 业 科 学 卷 ， ， ， ， （ · ） · · ： ； ； ； 土壤盐渍化是限制农林业生产和影响生态环境的一个非常重要的非生物胁迫因素，而生物工程已成为 改良植物适应盐渍化土壤最为理想和最有前途的方法，受到世界各国政府的高度重视。国内外研究主要涉 及盐胁迫条件下，植物在损伤蛋白的降解与修复、钠离子运输、渗透调节物质合成、钙调蛋白和胚胎发育晚期 丰富蛋白等方面发生的变化以及相关基因的克隆和转化，这些研究成果大大推动了植物耐盐遗传改良的进 程（ ， ）。迄今，已克隆了数十个与盐胁迫诱导表达相关的基因，证实了渗调物质如甜菜碱、脯 氨酸、山梨醇、甘露醇等在高等植物耐盐方面有渗透保护与调节作用，但这些物质单独对耐盐性的作用并不 显著，有的甚至与耐盐性无关（ ， ）。据报道，盐胁迫对植物生长发育的主要危害表现为， 在 细胞质中大量累积所导致的细胞生理生化代谢活动的抑制，以及胞内离子平衡的破坏。提高植物耐盐性的 一个重要方面就是降低胞质中的 含量。耐盐型植物把 排入液泡，这样不但减少了胞质中 的含 量，同时排入的 也可作为一种离子渗透调节剂，来克服高盐环境所引起的水分胁迫（ ， ）。 排入液泡主要是通过液泡膜上 （ ）来完成，这种反向转运由液泡膜上 和 所产生的跨膜 梯度来驱动（ ， ）。 反向运输蛋白基因（ ）是在细菌、植物和动物体内普遍存在的一类膜蛋白基因家族。第一个 基因由 等（ ）从人体中分离出来，而随后又相继分离出其他 个 成员并检测出它们具有 反向运输的功能（ ， ）。借助人的 序列，首先在模式植物拟南芥（ ）中分离出了 个 基因，序列分析显示其与人 基因的同源性较高（ ， ）。在 此基础上，先后在主要农作物如水稻（ ）、小麦（ ）、玉米（ ）和陆地棉 （ ）中以及果树如柑桔（ ）中分离出多个 成员。为了检测 转基因植 株对盐的耐受性，有研究者先后将 基因转入拟南芥、西红柿（ ）、欧洲油菜 （ ）中并对转基因植株进行了耐盐测定，研究结果表明，转 植株均可耐受 · 水溶液的浇灌，并能正常生长、开花和结实（ ， ； ， ； ）。 基因成员虽已从细菌、植物和动物中分离出来并进行了功能性检测，但对于高度杂合、世代周期较 长、树体高大，对经济建设和环境保护具有重要作用的用材树种来说还未见关于该基因分离和检测的报道。 因此，分离用材树种 基因并对其产物的功能进行研究显得尤为必要。为此，本研究以 和 的 核苷酸序列为信息探针，基于可利用的杨树 数据库和毛果杨（ ）全基 因组测序结果，通过电子杂交辅助的克隆技术，从毛白杨（ ）形成层 中分离得到 个 基因成员。在此基础上，进行了杨树基因组 杂交分析以及组织特异性和盐诱导的差异表达分 析。本研究为分离其他树种 成员以及阐明 的功能奠定了重要的基础。 材料和方法 植物材料 从河北省邱县 年生易县毛白杨雌株上取根部组织、韧皮部、形成层、未成熟木质部、成熟木质部、嫩叶 和成熟叶片材料并置于液氮中冻存备用。 总 的提取 按 和 （ ）描述的方法进行。 第 期 张德强等：杨树 反向运输蛋白基因（ 、 ）的克隆和检测 提取和 的合成 毛白杨根部组织、韧皮部、形成层、未成熟木质部、成熟木质部、嫩叶和成熟叶片材料总 的提取和 的合成分别按 （ ， ， ， ， ）和 试剂盒描述的方法 进行。 电子杂交 以 和 序列（ 注册号分别为 和 ）为信息探针，将其输 入瑞典和法国杨树 数据库（ ， ）以及毛果杨全基因组数据库（ ， ）同 源比较服务器进行 分析（ ， ），筛选出同源性在 以上的 和 作为候 选序列，然后逐一将这些序列送 核酸数据库检索，后将这些序列进行整合拼接，获得统计上完整的序列。 电子杂交探针制备 根据所得的 重叠群整合序列，在其可能的开放阅读框两端设计一对寡聚核苷酸引物： ： ， ， ， ， ， ， ， ： ， ， ， ， ， ， ： ， ， ， ， ， ， ： ， ， ， ， ， ， 应用 聚合酶链反应（ ）体系，以毛白杨形成层 为模板，加入 ， ! ! · ， · ， 聚合酶 （以上试剂购自 公司）， ! ! · 引物各 ，加适量双蒸水至 。于 ， （ ， ， ， ） ! ! ! ! ! 个循环 ， 热循环条件下，扩增出长约 的 片段。 ! 产物的克隆、测序及计算机分析 将 扩增得到的目的基因片断回收后连接于 上。连接产物转化大肠杆菌 ，筛选阳性克 隆，送上海联合基因公司测序。提取其质粒经酶切和 扩增来验证目的基因。应用 软件和 软件包程序推导出氨基酸序列并进行 检索分析，然后分别估算和预测推导蛋白质的分子量 和等电点。 基因组 用 、 、 、 、 分别酶切 毛白杨基因组总 。以 标记的 # ! 和 基因的编码区为探针，按照 和 试剂盒说明进行 杂交。 杨树苗木 处理 将 年生毛白杨苗木的根部浸入 营养液中，含 · 的 浓度处理 后取其 叶片进行 测定和 提取。 反应 依据 和 基因的编码区，分别设计一对能够扩增出 左右 片段的引物， 引物序列如下： ： ， ， ， ， ， ， ： ， ， ， ， ， ， ： ， ， ， ， ， ， ： ， ， ， ， ， ， 以逆转录合成的 第 链为模板。样品经 预变性 ，后进行 ， ， ， ， ， ， 个循环， 延伸 作 反应。 结果与讨论 毛白杨 !# 同源 的克隆及其结构特征分析 为了分离杨树 蛋白基因 序列，从拟南芥 和 序列出发，筛选杨树 和 毛果杨全基 因组数据库。对于 ，共获得 了 个候选序 列 、 、 、 和 （图 ），而对于 ，共获得了 个候选序 列 、 和 （图 ），这些候选的 和 与拟南芥的 同源性均在 以上，应用 软件包 程序拼接出较为完整的杨树 序列，整合后的 林 业 科 学 卷 和 的 序列全长分别为 和 左右（图 ）。根据理论序列，设计了能扩增 出编码区全长的 对引物 和 以及 和 ，以毛白杨形成层总 为模板 进行 扩增。扩增产物经 琼脂糖凝胶电泳分离（图 ），在大小分别约为 和 处各扩 增出一条明亮的特异条带。将扩增的特异片段回收、纯化并与 载体连接后克隆测序。测序结果表 明，克隆的这 个杨树 总长分别为 和 ，与理论上 整合的核苷酸序列完全一 致，故将其命名为 和 。在 和 序列中，基因内部含有完整的开放阅读框架，大 小分别为 和 ，可编码长度分别为 和 个氨基酸残基的蛋白质（基因注册号分别为 和 ）。运用 软件估算推导的这 个蛋白质的分子量分别约为 和 ，其等电点分别为 和 。 图 电子杂交获得的 （）和 （）表达序列标签（ ）和 重叠群示意图 （） （） 序列查新、预测的蛋白质一级结构及其系统发育进 化分析 将 和 基因序列与已公开的拟南芥基因序 列进行同源比较，发现它们与拟南芥的 和 （ 注册号分别为 和 ）高度同源，同 源性分别为 和 。 检索结果初步表明， 和 是林木中首次克隆的 蛋白基因。为了分析 和 蛋白质的一级结构特征，将 和 推导的氨基酸序列与拟南芥的 和 、水稻的 以及西红柿的 和 进行了同源比较和结 构分析，结果见图 。 与拟南芥、水稻和西红柿的 图 从毛白杨形成层 中扩增的 蛋白质氨基酸序列高度同源，同源性分别为 、 和 ， （）和 （） 电泳图 而 与 和 高度同源，同源性分别为 （） 和 ，但 和 蛋白质氨基酸同源性则很低，仅 （） 为 。由图 显示的 蛋白质一级结构可见，无论 ； 和 之间以及与拟南芥、水稻和西红柿 的同 从毛白杨形成层 中扩增出的特异片段 源性高与低，它们都含有 个转膜区域（由 ， ， … 等表 工 H 皿 皿 示）。在这 个转膜区域中， 与 、 和 以及 与 和 氨基酸序列高度相似，特别是 至 相似度更高，其中 和 被 皿 皿 V w 认为参与了 反向运输活动（ ， ）。 第 期 张德强等：杨树 反向运输蛋白基因（ 、 ）的克隆和检测 图 和 与其他植物 蛋白质一级结构比较 为了分析杨树 和 与其他生物 蛋白的系统发育进化关系，利用 软件 （ ， ）将在 注册的拟南芥（ ）、玉米（ ）、水稻（ 、 和 林 业 科 学 卷 图 和 与部分其他生物 的无根系统发育进化树 ）、小麦（ 和 ）、大麦（ ）（ ）、西红柿（ 和 ）、陆地棉 （ ）、柑桔（ ）、欧洲油菜（ ）、番薯（ ）（ ）、海蓬子（ ） （ ）、盐地碱蓬（ ）（ ）、老鼠（ ）（ ）、果蝇（ ） （ ）、酵母（ ）（ ）等 个物种共 个 蛋白氨基酸序列进行了序列 排列，后利用 软件（ ， ）得到了这些 蛋白的系统进化树（图 ）。从图 可见， 蛋白 由极点向 个方向发生了进化，其中有一分支在进化中占有主导地位，共有 个 蛋白属于该类，该类 全部由植物 蛋白组成。研究结果初步表明，占主导地位的这一分支的 蛋白主要附着在液泡膜上， 起 反向运输的作用（ ， ），而本研究中克隆的 就属于该类；第 分支包括 个 蛋白，该分支在进化过程的起始阶段就分成了 个小分支，一为植物 蛋白，另一为真菌酵母 蛋白。有研究表明这一类 蛋白与 反向运输的功能有关，对 盐不太敏感（ ， ）；第 个分支包括 个 蛋白，它们均属于动物类 蛋白，该类蛋白附着在动物体内质膜上，对 反向运输有重要作用（ ， ）。 和 基因的 杂交分析 利用能够酶切充分且探针内部不含有所用内切酶位点的限制性内切酶 、 、 、 、 ! ! ! 分别酶切 杨树总 。以 标记的 和 基因的编码区为探针，按照 ! # 和 试剂盒说 明进行 杂交分析，得到如图 所示的图谱。由图 可见，对于 基因，用 、 、 ! 酶切杨树总 时， 杂交分析均能得到 条杂交信号条带，而对于 基因，用 、 ! ! 、 酶切时，能得到 条杂交信号带，考虑到树木属于高度杂合类型的物种，因此，可以推测 ! ! 和 均为低拷贝基因（或有一些高度同源的基因），在杨树基因组中以 个拷贝形式存在。 第 期 张德强等：杨树 反向运输蛋白基因（ 、 ）的克隆和检测 ! # PtNHX 和PtNHX 基因的组织表达谱分析 采用 试剂盒分别提取杨树根部、韧皮部、形成 层、未成熟木质部、成熟木质部、嫩叶和老叶组织的总 并用紫外分光 光度计定量分析提取的各个组织的 含量。在此基础上，用 总 ! 为模板（图 ），按照 试剂盒描述的方法进行 反转录 反应分别得到各个组织部分的第 链 。为了检测转录的 的 浓度和质量情况，利用在植物体内广泛存在的杨树泛素结合酶（ ）基因序列设计的引物来扩增 模板，结果见图 ，可见，以这 个组织材料的 模板扩增的杨树泛素结合酶基因片 段的丰度基本一致，可用于 和 基因的组织表达谱分析。 依据 和 基因的编码区，分别设计一对能够扩增出 左右的 片段的引物 和 ，以及 和 ，以逆转录合成的 第 链为模板。样品 图 （）和 （） 经 预变性 ，后进行 ， ， ， 个循 基因的 杂交分析 环， 延伸 作 反应。反应产物经 琼脂糖凝胶电泳分 离后，用 染色后得到如图 和 所示的结果。 和 基 （） （） 因在杨树根、茎和叶片中均有表达，但其表达模式稍有不同： 在根 部、形成层、未成熟木质部、成熟叶和嫩叶中均高度表达，在韧皮部和成熟 木质部中有少量表达；而 在根部、成熟叶和嫩叶中表达丰度较 高，在韧皮部、形成层、未成熟木质部表达丰度较低，在成熟木质部中表达丰度极低。 图 和 基因的 组织表达谱分析 图 和 基因的 诱导差异表达分析 根部 ； 韧皮部 ； 形成层 ； 未成熟木质部 ； 成熟木质部 ； · ； · ； · ； ； 嫩叶 ； 成熟叶 · ； · ； · ! $ PtNHX 和PtNHX 基因的调控表达 为了检测 和 基因对 的诱导是否具有调控表达的作用，且有报道当植物在盐胁迫处 理时，植物叶片对盐的反应较为敏感，可积累较多的盐分（ ， ）。因此，本研究将 年生杨树苗 的根部浸入 营养液，溶液的 浓度在 · 设 个梯度（ ， ， ， ， ， · ）分别处理 后取其叶片进行 测定和 提取。与 和 基因的组织表达 谱分析一样，分别提取对照和不同 浓度处理后的叶片总 并进行定量分析，用泛素来检测反转录后 所得第 链 的质量和数量（图 、）。在此基础上，利用 检测了 和 对不同浓