大分子期刊影响因子直播_国际生物大分子期刊影响因子2022(2024年12月全新视觉)
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亚细胞定位实验常见问题解答 什么是亚细胞定位? 亚细胞定位是指生物大分子物质或脂类在细胞内的具体位置。蛋白质在细胞质中合成后,通过蛋白质分选信号被转运到特定的亚细胞结构中,参与细胞的各种生命活动。这个过程称为蛋白质亚细胞定位。 实验原理 利用GFP、RFP等荧光蛋白的独特荧光性质和灵敏性,可以示踪细胞内的蛋白。将目标蛋白与荧光蛋白的N端或C端融合,通过瞬转或稳转,使融合蛋白在受体材料细胞内表达。目标蛋白会牵引荧光蛋白一起定位到目标细胞器。经过激光共聚焦显微镜激光照射,荧光蛋白会发出荧光,通过观察荧光蛋白在细胞内显示的位置,可以确定目标蛋白的亚细胞定位情况。 常见问题 构建亚细胞定位载体时,GFP融合位置为什么有N端、C端之分? 如果序列中存在信号肽,构建载体时需避开这一端来融合荧光蛋白。不同的融合方式可能会得到不同的定位结果,例如融合在荧光蛋白N端的目标蛋白一般无法得到过氧化物酶体的定位结果;融合在荧光蛋白C端的目标蛋白一般无法得到线粒体、质体的定位结果。 为什么不同的受体材料有时得到的定位结果不一样? 不同物种的细胞在翻译表达基因时,其表达模式和影响因子不同。受物种差异的影响,同一个载体在不同的受体材料中表达的位置可能不同,因此建议实验时尽可能选用与目的基因来源相近的受体材料进行表达。 为什么要提供GFP空载的对照图片? 作为整个实验过程中的操作参照,可排除因实验操作而导致目的基因没有荧光信号的影响。作为载体体系的参照,确认构建载体时所使用的载体是可正常表达荧光蛋白的。 拍摄时为什么有明场通道? 显示细胞状态,有活力的细胞应该有正确且明显的细胞形态,变形或破碎的细胞说明此时细胞不是最适状态或细胞已死亡。显示荧光确实是细胞内蛋白表达的,而不是细胞碎片及杂质产生的杂光。 为什么不先对基因做预测,在预测的结果上直接做共定位? 不同的预测网站有不同的计算方法,同一个基因在不同的预测网站也可能得出不同的定位结果。另外所有的结果都应是基于实验得到的,对于不清楚可能定位在哪里的基因,一般推荐先做普通定位,根据普通定位的结果再决定做哪种细胞器的共定位。 适用于什么实验场景? 基因功能研究:文章里总少不了这一项。 研究蛋白相互作用:与酵母双杂实验结果相互验证。
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